Analisi batteriologica acqua

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Analisi batteriologica acqua

ANALISI BATTERIOLOGICA dell’acqua

INTRODUZIONE
Le indagini di tipo batteriologico, nell’acqua potabile, hanno lo scopo di evidenziare i possibili rischi infettivi legati alla presenza di germi patogeni.
Fra le principali malattie trasmissibili per via idrica possiamo elencare: febbre tifoidea (Salmonella typhi), febbri paratifoidee (Salmonella paratyphi A, B, C), salmonellosi a quadro gastroenterico (Salmonella spp), shigellosi (Shigella spp), colera (Vibrio cholerae), gastroenteriti dei bambini (E. coli enteropatogena), epatite infettiva di tipo A (HAV), amebiasi ecc.
Nella routine non sono tuttavia ricercati i vari germi patogeni, poiché questo richiederebbe tempi non conciliabili con la necessità di disporre con rapidità di dati attendibili, quindi, la ricerca è limitata ai microrganismi indici d’inquinamento fecale.Molti microrganismi patogeni, ad esempio quelli che provengono dal tubo digerente dell’uomo o dell’animale, sono accompagnati da altre specie batteriche più abbondanti , più facili da ricercare e meno pericolosi per la salute: sono i batteri “indicatori”
Gli indicatori denoteranno la probabile presenza di microrganismi patogeni. Inoltre, è possibile misurare la concentrazione di microrganismi indicatori prima e dopo un trattamento, ad esempio di potabilizzazione delle acque, per valutare l’efficacia dello stesso.

Un buon microrganismo indicatore dovrebbe:

essere sempre presente quando sono presenti i patogeni;
essere più numeroso dei patogeni, e quindi più facilmente rilevabile;
mantenere lo stesso comportamento dei patogeni nell’ambiente naturale;
poter essere evidenziato ed identificato utilizzando tecniche semplici e poco costose;
non essere patogeno.

Vengono utilizzati come indicatori di contaminazione fecale:
- batteri coliformi
- coliformi fecali (Escherichia coli)
- Enterococchi
- Clostridium perfringens e sue spore (una volta venivano chiamati Clostridi solfito-riduttori)

Secondo il D.Lg 31_2001 i parametri microbiologici da determinare e i loro limiti sono:

Parametro	Valore di parametro (Numero/100 ml)
*Clostridium perfringens* (spore comprese)	0
Conteggio delle colonie a 22 °C	Senza variazioni anomale
*Escherichia coli* (E. coli)	0
Enterococchi	0
Batteri coliformi a 37°C	0

Dei parametri sopra citati il D.Lg 31_2001 considera parametri indicatori: Clostridium perfringens (spore comprese), Conteggio delle colonie a 22 °C, Batteri coliformi a 37°C
Per le acque messe in vendita in bottiglie o contenitori sono applicati i seguenti valori:

Parametro	Valore di parametro
*Escherichia coli* (E. coli)	0/250 ml
Enterococchi	0/250 ml
Pseudomonas aeruginosa	0/250 ml
Conteggio delle colonie a 22°C	100/ml
Conteggio delle colonie a 37°C	20/ml

Vanno sottoposti a controllo di routine almeno i seguenti parametri:

Escherichia coli (E. coli) –
Batteri coliformi a 37°C
Clostridium perfringens (spore comprese) (Necessario solo se le acque provengono o sono influenzate da acque superficiali .-
Pseudomonas aeruginosa (Necessario solo per le acque vendute in bottiglie o in contenitori.) –
Conteggio delle colonie a 22°C (Necessario solo per le acque vendute in bottiglie o in contenitori.)
Conteggio delle colonie a 37°C (Necessario solo per le acque vendute in bottiglie o in contenitori.)

A giudizio dell'Autorità sanitaria competente, potrà essere effettuata la ricerca concernente i seguenti parametri accessori
Alghe, batteriofagi anti-E. coli, elminti, enterobatteri patogeni, enterovirus, funghi, protozoi, Pseudomonas aeruginosa, Stafilococchi patogeni. Devono comunque essere costantemente assenti nelle acque destinate al consumo umano gli Enterovirus, i Batteriofagi anti-E.coli, gli Enterobatteri patogeni e gli Stafilococchi patogeni.
Secondo il D.Lg 31_2001 i Metodi di indagine microbiologica sono :• Conta totale ISO 6222,• Escherichia coli ISO 9308-1,• Batteri coliformi ISO 9308-1, Enterococchi ISO 7899-2, Pseudomonas aeruginosa ISO 12780, Clostridium perfringens: norma ISO non
ancora esistente, terreno indicato m-CP agar.

CAMPIONAMENTO
Il prelievo dei campioni per l’esame microbiologico deve essere effettuato in contenitori di vetro o di polietilene puliti e sterili. Per i prelievi da effettuare per immersione della bottiglia si devono usare bottiglie sterile incartate prima della sterilizzazione e dotate di dispositivi adatti all’apertura a comando del tappo. Le bottiglie non devono essere mai sciacquate all’atto del
prelievo, esse devono essere aperte avendo cura di non toccare la parte del tappo che viene a contatto con il campione e la parte interna del collo della bottiglia; subito dopo la raccolta del campione la bottiglia deve essere richiusa. Non riempire mai completamente la bottiglia al fine di consentire una buona agitazione del campione in laboratorio. Se l’acqua daesaminare è clorata le bottiglie devono contenere sodio tiosolfato in concentrazione adatta alla neutralizzazione del biocidi. Per le normali concentrazioni di cloro sarà sufficiente 0,1 mldi una soluzione di tiosolfato di sodio 10% per ogni 100 ml di campione. Prelevare un volume di campione d’acqua idoneo allo svolgimento delle analisi previste. Identificare il campione in
modo adeguato.
Tutti i campioni d’acqua devono essere esaminati nel minore tempo possibile ed il loro trasporto deve avvenire in modo tale che sia garantita una temperatura di conservazione tra i +4 ed i +10°C. Tra il momento del prelievo e quello dell’analisi il tempo massimo che può
intercorrere, per le varie determinazioni, è indicato nella tabella che segue:
Campylobacter 6 – 8 ore
Organismi vitali a 22°C o 36°C, Staphylococcus, P.aeruginosa 8 - 12 ore
E.Spore clostridi solfito riduttori, batteriofagi, Enterovirus, Cisti/Oocisti di Giardia
e Cryptosporidium, Legionella, uova di elminti, Cianobatteri, Amebe 48 -72 ore
La ricerca dei patogeni deve essere effettuata, rispetto agli indicatori, su quantitativi più elevati di acqua, ma, mentre il loro rilevamento testimonia ovviamente della loro sicura presenza, un risultato negativo non depone per la loro sicura assenza.

Ricerca dei coliformi ed E.coli nelle acque destinate ad uso umano- secondo

UNI EN ISO 9308-1:2002

1- TERMINI E DEFINIZIONI
I batteri coliformi sono batteri Gram-negativi non sporigeni, ossidasi negativi, a forma di
bastoncello che sono caratterizzati da crescita aerobica e anaerobica facoltativa capaci di vivere in
presenza di sali di bile (o altri agenti attivi di superficie con proprietà simili) e che sono normalmente in grado di fermentare il lattosio con la produzione di acido e aldeide entro 48 h quando incubati a una temperatura di (36 ± 2) °C. Essi possiedono anche l'enzima ß-galattosidasi.
La specie Escherichia coli è costituita da batteri coliformi in grado di produrre indolo dal triptofano entro
(21 ± 3) h a (44,0 ± 0,5) °C.

1.1 batteri lattosio-positivi
: (prova normalizzata) Batteri in grado di formare colonie aerobicamente
(36 ± 3) °C su un terreno colturale selettivo e differenziale contenente lattosio
con la produzione di acido entro (21 ± 3) h.
1.2 batteri coliformi
(prova normalizzata) Batteri lattosio-positivi come definiti in 1.1 che
sono ossidasi negativi.
1.3 Escherichia coli
(prova normalizzata) Batteri coliformi come definiti in 1.2 che producono
anche indolo da triptofano a (44,0 ± 0,5) °C entro (21 ± 3) h.

2-PRINCIPIO
2.1 Descrizione generale del metodo
Il metodo è basato sulla filtrazione su membrana e consiste di due parti, la prova normalizzata
di riferimento e la prova rapida opzionale, che può essere eseguita in parallelo
La prova normalizzata include l'incubazione della membrana su un terreno selettivo con successiva ulteriore caratterizzazione biochimica delle tipiche colonie lattosio-positive, che porta alla ricerca ed enumerazione dei batteri coliformi ed Escherichia coli entro 2 - 3 giorni.
2.2 Filtrazione e incubazione
Porzioni di prova del campione sono filtrate attraverso membrane che trattengono i batteri. Una membrana (prova normalizzata) è posizionata su un terreno agarizzato al lattosio selettivo Tergitol+TTC (Tergitol 7 Agar) che è incubato a (36 ± 2) °C per (21 ± 3) h .
2.3 Valutazione e conferma, prova normalizzata
Le colonie caratteristiche su Tergitol 7 Agar (colonie gialle) sono conteggiate come batteri
lattosio-positivi.
Interpretare i risultati su TTC Tergitol 7 Agar come segue:
* colonie violetto: riduzione del TTC;
*colonie gialle: assenza di riduzione del TTC;
colonie gialle con alone giallo: fermentazione del lattosio;
colonie gialle alone blu: assenza di fermentazione del lattosio.
• E.coli coltiva con colonie gialle con centro a volte rosso arancio, ed alone giallo.
• Enterobacter/Klebsiella coltivano con colonie gialle
• Salmonella/Shigella/Proteus/Pseudomonas: coltivano con colonie rosso-viola con alone blu.

Per i batteri coliformi ed Escherichia coli, la coltura secondaria è effettuata
a partire da colonie caratteristiche selezionate in modo casuale per le prove di
conferma: ossidasi e produzione di indolo. È conteggiato il numero di batteri coliformi
lattosio-positivi ed Escherichia coli probabilmente presenti in 100 ml del campione.

3 PROCEDIMENTO
3.1 Preparazione del campione
Per preparazione del campione, filtrazione e inoculo su terreno di isolamento, seguire le
istruzioni fornite nella ISO 8199 e ISO 6887-1. Iniziare l'esame preferibilmente subito
dopo aver prelevato i campioni. Se i campioni sono conservati a temperature ambiente
(nell'oscurità, non eccedenti i 25 °C), l'esame deve iniziare entro 6 h dopo il prelevamento
del campione. In circostanze eccezionali, i campioni possono essere conservati a
(5 ± 3) °C per un massimo di 24 h prima dell'esame.
3.2 Filtrazione
Filtrare 100 ml (o volumi superiori, per esempio 250 ml per acqua imbottigliata) del
campione da studiare utilizzando un filtro a membrana. Posizionare il filtro sul
rispettivo terreno agarizzato (Tergitol 7 Agar) verificando che non rimanga aria intrappolata al
di sotto del medesimo.
3.3 Incubazione e differenziazione, prova normalizzata
Incubare a (36 ± 2) °C per (21 ± 3) h.
Il prolungamento del tempo di incubazione a (44 ± 4) h può causare una più alta sensibilità della prova e può
essere particolarmente utile per le piastre che non mostrano colonie tipiche dopo (21 ± 3) h.
Esaminare le membrane e contare come batteri lattosio-positivi tutte le colonie caratteristiche,
a prescindere dalle dimensioni, che mostrano lo sviluppo di una colorazione gialla
nel terreno sotto alla membrana. Per le prove di ossidasi e indolo, sottoporre a coltura secondaria preferibilmente tutte, o un numero rappresentativo (almeno dieci), delle colonie caratteristiche ottenute rispettivamente su agar non selettivo Triptone Soia Agar (TSA ) (B.3).e in brodo di triptofano (B.2).
Incubare l'agar non selettivo a (36 ± 2) °C per (21 ± 2) h ed eseguire la prova di ossidasi (Considerare la comparsa di una colorazione blu profondo-viola entro 30 s come reazione positiva)
Incubare la provetta di brodo di triptofano a (44,0 ± 0,5) °C per (21 ± 3) h ed
esaminare la produzione di indolo aggiungendo da 0,2 ml a 0,3 ml di reattivo di Kovacs
. Lo sviluppo di una colorazione rosso - ciliegia sulla superficie del brodo conferma
la produzione di indolo.
Contare tutte le colonie che producono una reazione di ossidasi negativa come batteri
coliformi.
Conteggiare tutte le colonie che producono una reazione di ossidasi negativa e una
reazione dell'indolo positiva come Escherichia coli
.
4 ESPRESSIONE DEI RISULTATI
Dai numeri delle colonie caratteristiche contate sulla membrana (8.3) e tenendo conto dei
risultati delle prove di conferma eseguite, calcolare la carica di Escherichia coli, batteri
coliformi e, se necessario, batteri lattosio-positivi presenti in 100 ml del campione in
conformità alla ISO 8199.
5 RAPPORTO DI PROVA
Il rapporto di prova deve contenere almeno le informazioni seguenti.
a) il riferimento della presente parte della ISO 9308;
b) tutti i dettagli necessari per l'identificazione completa del campione;
c) i risultati espressi in conformità con il sopracitato punto 4;
d) qualsiasi particolare/i circostanza/e osservata/e durante il corso dell'analisi e
qualsiasi operazione/e non specificata/e nel metodo che può/possono avere
influenzato i risultati.

APPENDICE B TERRENI COLTURALI E REAGENTI
TERGITOL 7+TTC
B.1.1 Terreno basale
Lattosio 20 g
Peptone 10 g
Estratto di lievito 6 g
Estratto di carne 5 g
Blu di bromotimolo 0,05 g
Agar (in polvere o sotto forma di scaglie) da 15 g a 25 g1)
Acqua distillata 1 000 ml
Disciogliere gli ingredienti in acqua mediante riscaldamento. Se necessario, regolare il pH
in modo che dopo la sterilizzazione abbia un valore corrispondente a 7,2 ± 0,1 a 25 °C.
Distribuire il terreno in bottiglie, in volumi massimi di 250 ml e sterilizzare in autoclave a
(121 ± 3) °C per 15 min.
B.1.2 Soluzione di TTC
2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (TTC) 0,05 g
Acqua distillata 100 ml
Disciogliere il TTC in parte dell'acqua e portare quindi ad un volume di 100 ml. Sterilizzare
per filtrazione attraverso una membrana di dimensioni nominali dei pori di 0,2 m.
B.1.3 Soluzione di eptadecilsolfato di sodio
Eptadecilsolfato di sodio (Tergitol2) 7) 0,2 g
Acqua distillata 100 ml
Disciogliere l'eptadecilsolfato di sodio in parte dell'acqua e portare quindi ad un volume di
100 ml. Sterilizzare in autoclave a (121 ± 3) °C per 15 min.
B.1.4 Terreno completo
Terreno basale (B.1.1) 100 ml
Soluzione di TTC (B.1.2) 5 ml
Soluzione di eptadecilsolfato di sodio (B.1.3) 5 ml
Sciogliere il terreno basale e raffreddare a (50 ± 5) °C. Aggiungere le soluzioni di TTC e
eptadecilsolfato di sodio in modo asettico, miscelare completamente ma evitare la formazione
di bolle dopo ogni aggiunta. Distribuire in capsule di Petri a uno spessore di almeno
5 mm. Se non è per l'utilizzo immediato, conservare a (5 ± 3) °C nell'oscurità per non più
di 10 giorni.

B.2 Brodo di triptofano
Digerito triptico di caseina 10 g
L-Triptofano 1 g
Cloruro di sodio 5 g
Acqua distillata fino a 1 000 ml
Disciogliere gli ingredienti in acqua mediante riscaldamento. Distribuire 3 ml per ogni
provetta. Chiudere le provette con tappi in cotone, plastica o metallo. Sterilizzare in
autoclave per 15 min a (121 ± 3) °C. Il pH del terreno pronto all'uso dovrebbe essere
7,5 ± 0,1 a 25 °C.

B.3 Triptone Soia Agar (TSA)
Digerito triptico di caseina 15 g
Peptone di soia 5 g
Cloruro di sodio 5 g
Agar (in polvere o sotto forma di scaglie) da 15 g a 25 g1)
Acqua distillata fino a 1 000 ml
Disciogliere gli ingredienti in acqua mediante riscaldamento. Se necessario, regolare il pH
in modo che dopo la sterilizzazione abbia un valore corrispondente a 7,2 ± 0,1 a 25 °C.
Distribuire il terreno in bottiglie o provette in volumi di massimo 250 ml e sterilizzare per
15 min a (121 ± 3) °C. Consentire al terreno di raffreddarsi a (50 ± 5) °C e distribuire in
capsule di Petri a uno spessore di almeno 5 mm.
Nota Per la prova di ossidasi, possono essere utilizzati agar non selettivi (invece del TSA) che non interferiscono
con la prova di ossidasi (con basso contenuto di carboidrati fermentabili).

Ricerca Enterococchi con il metodo MF secondo DPR 31/2001
(ISO 7899-2)

Il gruppo degli enterococchi è un sottogruppo del genere Streptococcus che include streptococchi del gruppo D (E. faecalis subsp. faecalis, E. faecalis subsp. faecium E. gallinarum, E. faecalis subsp. liquefaciens, E. faecalis subsp. casselliflavus, E. faecalis subsp. zymogenes, E. flavescens, E. faecium, E. hirae, E. durans) e streptococchi del gruppo Q (Enterococcus avium).
Enterococcus faecalis ed Enterococcus faecium sono le specie più frequentemente isolate dal tratto gastrointestinale e quindi la loro presenza nell'ambiente è correlabile con certezza a contaminazione fecale.Questi batteri sono cocchi Gram-positivi , immobili e asporigeni. Si raggruppano a formare catenelle e in vivo sono dotati di una capsula che viene rapidamente perduta nelle colture su terreni artificiali.Sono presenti nelle feci umane o di animali a sangue caldo. Essi sono ossidasi-negativi, catalasi-negativi, posseggono il gruppo antigene D di Lancefield e idrolizzano l'esculina.
Sono capaci di crescere in ambiente aerobico e anaerobico, in presenza di sali biliari, in soluzioni contenenti sodio azide a concentrazioni che inibiscono la crescita di batteri coliformi e di molti altri batteri Gram-negativi.
Sono un gruppo microbico eterogeneo le cui specie sono state di recente revisionate sotto il profilo di appartenenza tassonomica.
La disomogeneità di questo genere hanno indotto gli esperti della Unione Europea a designarli, nella nuova direttiva per le acque destinate a consumo umano, , non più come "Streptococchi fecali" ma come "Enterococchi". Gli enterococchi, quindi, si identificano come quelle specie incluse nel nuovo genere Enterococcus.
Gli enterococchi sono caratterizzati da persistenza maggiore rispetto a quella di Escherichia coli e dei coliformi fecali nelle acque contaminate e in quelle sottoposte al trattamento di disinfezione. Resistono, infatti, a condizioni di disidratazione per cui sono indicatori, in aggiunta ai coliformi e alle spore di clostridi solfitoriduttori, dell'efficienza dei trattamenti di potabilizzazione delle acque.
Il Decreto Legislativo 2 febbraio 2001 n.31 prevede che per la ricerca degli enterococchi venga applicata la norma ISO 7899 in cui è previsto l'utilizzo del terreno di Slanetz and Bartley
e la verifica dell'idrolisi dell'esculina come ulteriore prova di differenziazione da altri microrganismi.
Per la ricerca degli enterococchi è previsto l'utilizzo della filtrazione su membrana del campione (100ml o 250 ml per acque vendute in bottiglia) e deposizione di essa sul terreno di Slanetz and Bartley con incubazione a 37°C per 48 h. Il terreno risulta selettivo per la presenza di azide sodica che inibisce la crescita dei Gram negativi e contiene il T.T.C. (trifenil tetrazolio cloruro), un composto che è utilizzato dalle cellule batteriche metabolicamente attive che lo riducono a formazano di colore rosso/violetto. Si considerano positive le colonie color rosso mattone. Non tutte le specie sono in grado di ridurre il TTC , perciò si prendono in considerazione anche le colonie di colore più pallido . Per evitare attribuzioni non specifiche delle colonie al gruppo degli enterococchi, la norma prevede un ulteriore prova di differenziazione.Le membrane vengono trasferite su una piastra di Bile Esculin Azide agar e incubate per due ore a 44°C: vengono considerate come enterococchi le colonie che diventano marroni o nere o che mostrano alone scuro.. Gli enterococchi sono capaci di crescere in presenza di bile e idrolizzano l'esculina ad esculetina e destrosio; l'esculetina reagisce con un sale di ferro contenuto nel terreno (citrato ferrico) formando un complesso bruno-nero, per cui le colonie degli enterococchi assumono queste colorazioni.

Fonte: citazione / estratto da http://www.divini.net/dc/courses/CHO5/document/analisi_batt_legge_31_2001_dispense_2008.doc?cidReq=CHO5

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